WB做得好，无敌战导师捡到宝。白提对于刚入实验室的无敌战热血青铜宝宝，WB可谓处处都是白提轰炸区，一个不小心，无敌战分分钟落地成盒。白提为了帮助大家快速get变强秘籍，无敌战提升吃鸡率，白提我们在此重磅推出《WB实验全攻略》系列文章，无敌战助力各位早日成为实验室MVP，白提进阶WB无敌战神。无敌战
蛋白提取是白提WB的第一步，也是无敌战实验成功的关键环节，其核心思想是白提确保待检测的蛋白样品不被降解，整个制备过程应在低温下进行。无敌战本期内容主要介绍组织或细胞蛋白提取的前期准备、实验步骤和注意事项。你准备好了么？
A、表达模式，了解表达模式对于取材十分重要。如果你的蛋白仅在癌症组织中表达，那取正常组织就只适合当阴性对照了。
B、定位，蛋白定位对于蛋白提取方式和内参的选择非常重要。
C、分子量，了解蛋白的分子量对于有助于优化跑胶、转膜等环节。
D、是否存在可变剪切、翻译后修饰等，了解清楚这些，后期看到“杂带“也不慌了。
E、其它特性，是否需要诱导和易被泛素化降解等，有备无患，不做无用功。
根据蛋白类型选择合适的裂解液
RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液，适用于提取全细胞蛋白和膜结合蛋白，通常是western blot提取蛋白的首选裂解液。RIPA裂解液包含以下几个组份：缓冲系统、盐离子、表面活性剂和蛋白酶抑制剂。
对于一些本底丰度低或容易降解的蛋白，需要一些特殊处理，如添加蛋白/修饰诱导剂或相关酶抑制剂。
裂解液在使用前需加入蛋白酶抑制剂，商品化的蛋白酶抑制剂 (如cocktail) 含有可抑制各类蛋白酶的抑制剂，但价格昂贵，实验室可根据需要自行研制蛋白酶抑制剂，可达到类似的抑制效果。
01、PBS清洗细胞或研磨组织 (液氮研磨或匀浆器) ；
02、加入适量的裂解液 (已添加蛋白酶抑制剂) 裂解细胞 (通常比例为每106个细胞中加入100 μL裂解液；裂解液的体积根据组织总量来决定，蛋白提取物不宜过于稀释，以避免蛋白质损失，并尽量减少样品体积以便上样，最小浓度为0.1 mg/mL；最佳浓度为1-5 mg/mL)；
03、低温持续振荡15-30 min；
04、冰上超声，20-30%功率，1-2 min，或者使用1 mL注射器进行抽打，断裂DNA；
05、低温最高转速离心20 min，上清即为蛋白样本。
1.如何减少蛋白降解?
组织和细胞中的蛋白酶在裂解的过程中可能会使目的蛋白降解，可通过以下几个方面来减少降解：
a.蛋白降解看酶活，提取温度要合适。提取蛋白时，应避开蛋白酶的最适温度。常见的哺乳动物组织或细胞的蛋白样品制备应全程低温。对于斑马鱼等冷血动物，可在高温条件下 (50-60°C左右) 提取蛋白。
b.组织取样分先后，操作过程要迅速。解剖时，取样应最先取消化系统和腺体相关的组织 (如胃、大小肠、肝脏、胰腺等) 和富含巨噬细胞的组织 (如肺) ，然后取生殖相关的组织 (如卵巢、子宫、睾丸等) ，最后取心、脾、肾、脑等器官。取下的组织若不立即使用，应冻存于液氮或-80°C冰箱，但应尽量选取新鲜的样品进行制备 (尤其是消化系统相关的组织样品) 。敲黑板！！新鲜材料的WB结果信号更强，背景更低 (见下图) ，如操作不当导致样品反复冻融，应终止实验。少数细胞系，如Raw 264.7、U-937等，也含较多蛋白酶，在提取时也需要快速提取，可考虑用含高浓度SDS的裂解液以缩短裂解时间。
c.胰蛋白酶有影响，培养流程要优化。如果提取贴壁细胞的膜蛋白，尤其要考虑胰蛋白酶对蛋白的剪切。在传代过程中，目的蛋白可能会被胰蛋白酶剪切，从而在WB中检测出杂带或得到阴性结果，因此，细胞培养的最后一次传代尽可能低密度传代，使细胞有足够的时间表达新的膜蛋白。此外，在收集贴壁细胞时，也不建议用胰蛋白酶消化，而是应该直接裂解，也可以刮细胞后再裂解。
2.如何减少杂质干扰?
蛋白提取物经常含有一些杂质，影响后期的电泳分离，可通过以下方法进行优化。
3.若组织块较大，可先用锡箔纸包裹，用锤子锤成小块，再转移到研钵中液氮研磨。研钵研磨前需预冷；研磨过程中穿戴棉手套，谨慎操作，避免液氮冻伤皮肤；若组织块较小，可直接用匀浆器匀浆。如组织研磨过程中因操作不当导致样品飞溅丢失或样品研磨不充分，应按实验失败处理，不得进行下一个环节。
4.总蛋白溶液能够检测大多数蛋白在整个细胞中的表达。若目的蛋白是膜蛋白或特定细胞器特异蛋白，可借助特定的分离试剂盒进行操作(查阅文献或相关试剂盒说明书进行选择)。
5.PMSF等蛋白酶抑制剂可损害呼吸道、眼睛及皮肤，因此需要注意防护。
